1. Применение кальциевых носителей

ОБРАЗОВАНИЕ КОСТИ И ОЧАГОВ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ СОВМЕСТНОМ ПРИМЕНЕНИИ КАЛЬЦИЕВЫХ НОСИТЕЛЕЙ С КЛЕТКАМИ КОСТНОГО МОЗГА ИЛИ С КУЛЬТИВИРОВАННЫМИ МЕЗЕНХИМНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

Устранение массивных дефектов кости оста­ется сложной задачей реконструктивной хирур­гии. Применение для этой цели деминерализо­ванного костного матрикса, способного индуциро­вать рост костной ткани, выявило различные ог­раничения и вызвало разноречивые оценки. В некоторых случаях используют аутологичную кость, однако данный метод часто связан с труд­ностью и болезненностью процедуры извлечения кости, с высоким риском инфекций, геморрагий, повреждения нервов и утраты функций. Избе­жать этих проблем можно, используя носители из синтетических и натуральных биоматериалов, которые в сочетании с клетками костного мозга или с выделенной популяцией мезенхимных стромальных клеток (МСК) индуцировали бы проли­ферацию, миграцию и дифференцировку клеток кости. МСК можно выделить в условиях куль­тивирования клеток костного мозга в пластико­вой посуде. Они способны дифференцироваться в клетки костной, хрящевой, жировой ткани.

Комбинация МСК с различными носителями мо­жет значительно улучшить восстановление кост­ной ткани при обширных повреждениях кости. Одним из наиболее эффективных биоматериалов оказался очищенный от органических веществ на­туральный скелет кораллов. Использование его в сочетании с МСК позволило полностью заместить большой костный дефект у овцы. Понятно, что применение кораллов в широкой практике затруднено из-за сложности очистки и неодно­родности исходного материала. Показано, что ис­пользование в качестве носителя вещества кости в сочетании с МСК дает субоптимальные резуль­таты. Предпринимались также попытки ис­пользовать керамические носители, такие как гидроксиапатит — трикальциум фосфат, однако выяснилось, что в чистом виде он затрудняет рост новой кости и не имеет достаточных поддержи­вающих механических свойств.

Целью нашего исследования было определить наиболее пригодный для роста МСК и одновременно применяемый в восстановительной хирур­гии биоматериал.

Материалы и методы

Исследовано два носителя — Osteoset® и Prodens®, оба фирмы «Wright Medical Technology, Inc.». Osteoset представляет собой специально об­работанные кристаллы сульфата кальция, кото­рые деградируют в организме в течение 6 нед. Prodens является композитным материалом, на 93% состоящим из сульфата кальция и на 7% — из гидр-оксиапатита. Носители тестировали как без добав­ления клеток, так и помещая на них взвесь клеток костного мозга или слой прилипающих клеток (СПК) из длительной культуры костного мозга (ДККМ). СПК содержит мезенхмные стволовые клетки, обладающие самоподдержанием и способ­ные при ретрансплантации образовывать полно­ценное кроветворное микроокружение, МСК и их потомки, представленные всеми линиями мезенхимной дифференцировки.

В качестве модельной системы, позволяющей оценить пригодность биоматериалов, использова­ли трансплантацию носителей с клетками и без клеток под кожу и под капсулу почки мышей. Помещение анализируемых гранул под кожу мо­делировало образование костной ткани в месте с ограниченным кровоснабжением, имплантация гранул под капсулу почки позволяла оценить ин­дукцию костной ткани при интенсивном крово­снабжении. Известно, что при помещении кост­номозгового цилиндра под капсулу почки сингенных мышей через 6 нед образуется очаг эктопи­ческого кроветворения с развитой стромой кост­ного мозга и костной раковиной. В очаге эктопи­ческого кроветворения строма принадлежит до­нору, а кроветворение — реципиенту. Поме­щение взвеси клеток костного мозга под капсулу почки на нитроцеллюлозных фильтрах не инду­цирует образование очага.

В работе использовали самок мышей-гибри­дов (СВА х C57B16)F1 в возрасте 3-4 мес к нача­лу экспериментов и беспородных кроликов мас­сой 2,5—3 кг.

Для проверки эффективности адсорбции кле­ток на носителях использовали МСК кролика. МСК получали из костного мозга кролика, аспирированного в физиологический раствор, содержащий 500 ЕД гепарина. МСК культивировали в среде осМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Hyclone»), 2 мМ L-глутамина (ICN), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн»), 50 мкг/мл стрептомици­на («Ферейн»). После формирования конфлуент-ного монослоя клетки снимали 0,25% раствором трипсина, приготовленного на 0,02% EDTA (ICN) в физиологическом растворе («Sigma»), и рас­саживали из расчета 4х103 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона. Носители помещали в ячейки 96-ячеечной платы и смачивали пита­тельной средой в течение 5 мин или 24 ч до помещения на них МСК 1-3-го пассажа в количестве 50 000, 100 000 или 200 000 клеток в 200 мкл среды. Через 2 и 4 ч подсчитывали число клеток, не по­павших в гранулу носителя. В качестве контроля использовали посадку клеток без носителя.

мебель