2. Применение кальциевых носителей

Носители со взвесью клеток костного мозга сингенных животных и без клеток помещали под кожу (Osteoset и Prodens) и под капсулу почки (Prodens) мышей. Osteoset не тестировали под капсулой поч­ки из-за большого размера гранул. В качестве конт­роля использовали взвесь клеток костного мозга на синтетических фильтрах («Millipore») с диамет­ром пор 0,45 нм, которые помещали под кожу и под капсулу почки. Мышей оперировали, как опи­сано И.Л. Чертковым и соавт., под наркозом (Авертин, Aldrich).

Длительную культу костного мозга Декстеровского типа получали стандартным способом. Использовали полностью сформированные под­слои от 4—6-недельных культур. Для получения взвеси из СПК флаконы с культурой декантиро­вали, дважды промывали раствором Версена и добавляли 0,025% раствор трипсина (ICN). Дей­ствие трипсина останавливали добавлением сре­ды с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Полученную суспензию клеток осаждали цент­рифугированием при 1000 об/мин.

Чтобы установить, влияет ли предварительная индукция остеогенной дифференцировки на рост костной ткани, в течение последних 2 нед куль­тивирования к ДККМ при каждой смене среды добавляли 10% концентрата среды следующего состава: 1 мкМ дексаметазона, 1,5 мМ аскорбат-2-фосфата, 30 мМ NaH2PO4 (все фирмы «Sigma»). Клетки взвеси костного мозга, СПК и взвеси СПК помещали на фильтр или на пресмоченный в течение 10—120 мин в питательной среде носи­тель на 2-3 ч.

Носители, любезно предоставленные ООО «IKVAA», с соответствующими клетками и без них помещали в организм на 6 нед, затем трансплан­таты извлекали, фиксировали в растворе Буэна, приготавливали срезы толщиной 5 мкм, окраши­вали их по Маллори для выявления разных ком­понентов соединительной ткани и изучали с помо­щью светового микроскопа.

Результаты

Исследование эффективности адсорбции кле­ток на носителях до трансплантации показало, что МСК высокоэффективно прикрепляются на носи­телях уже за 2 ч (рис. 1). Очевидно, что этого вре­мени достаточно для кокультивирования клеток с носителем.

 

2. Применение кальциевых носителей

 

При изучении свойств Prodens выявлено, что при помещении этого носителя как под капсулу почки, так и под кожу вокруг гранулы образуется тонкая соединительно-тканная капсула, встреча­ются кровеносные сосуды и области тяжей колла­гена (рис. 2, а, б). Костная ткань и участки кроветворения отсутствует. Гранулы Osteoset под ко­жей растворяются, и на их месте формируются соединительно-тканные образования, аналогичные описанным выше (рис. 2, в).

При помещении взвеси клеток костного мозга на фильтре под кожу и под капсулу почки кост­ной ткани не образуется (рис. 3).

Отсутствие кост­ной ткани наблюдается и в случае имплантации взвеси клеток костного мозга на грануле Osteoset под кожу. При использовании Osteoset выявлено, что широкая зона вокруг гранулы заполнена кол-лагеновыми волокнами, многочисленными фибробластами и кровеносными сосудами. Взвесь кле­ток костного мозга, помещенная на гранулу Prodens, под кожей также не образует костной ткани: на срезах видны соединительно-тканная капсула, коллагеновые тяжи и фибробласты (рис. 4, а). В то же время при помещении гранулы Prodens со взвесью клеток костного мозга под кап­сулу почки, помимо соединительно-тканной кап­сулы, образующейся вокруг гранулы, наблюда­ются участки костной ткани и костномозгового кроветворения. На рис. 4 (б) видны ткань почки, коллагеновые тяжи, образующаяся костная ткань и участок с кроветворными клетками.

Таким образом, один из двух исследованных носителей — Prodens в соответствующем месте (в данном эксперименте — только под капсулой почки) стимулирует образование костной ткани даже из предварительно разобщенных клеток костного мозга.

 

 

Известно, что разобщение клеток костного моз­га и превращение их в одноклеточные суспензии ингибирует рост стромальных предшественников. Поэтому в следующей серии экспериментов на носители помещали СПК из ДККМ без предвари­тельного превращения их в суспензию. Контролем служила имплантация неразобщенных СПК без носителя под капсулу почки. В этом случае под капсулой почки формировался очаг эктопического кроветворения с выраженной костной раковиной. На рис. 5 (а) отчетливо видны участок костной тка­ни и полноценный очаг кроветворения с жировы­ми клетками, дифференцирующимися кроветвор­ными клетками всех ростков кроветворения, вклю­чая мегакариоциты. При добавлении в ДККМ сре­ды для остеогенной дифференцировки и последу­ющей имплантации таких СПК без носителя под капсулу почки также образовывались очаги с хо­рошо выраженной костной тканью, однако крове­творение в таких трансплантатах практически отсутствовало. На рис. 5 (б) видны ткань почки и значительная по размеру костная раковина. Наблюдалось очень небольшое скопление кро­ветворных клеток в районе кости. Кроме того, СПК на фильтре под кожей формировали плотные участки коллагеновых волокон и участки крове­творения (рис. 5, в). Таким образом, изучение контрольных препаратов показало, что неразоб­щенные СПК длительных культур костного мозга.

сайт-визитка